راهنمای کاربردی در تشخیص افتراقی باکتری ها

 همانگونه که مستحضرید باسیلهای گرم مثبت هوازی / بیهوازی اختیاری را به انواع اسپوردار و فاقد اسپور تقسیم بندی کردیم . انواع اسپور دار را در شماره 11 و انواع فاقد اسپورکاتالاز منفی را در شماره های 12و13 ماهنامه معرفی نمودیم .دراینجا به معرفی باسیل های گرم مثبت هوازی / بی هوازی اختیاری بدون اسپورکاتالاز مثبت مهم یعنی جنس های �کورینه باکتریوم� و �لیستریا �می پردازیم . کورینه باکتریوم ها برخلاف لیستریا ها ، بایل اسکولین (بجز C.kutscheri ) وحرکت (در c˚25) منفی هستند . خصوصیات هر دو جنس و نیز وجوه افتراقی گونه های مربوطه، جداگانه توضیح داده می شود:

جنس کورینه باکتریوم (Corynebacterium):

باکتری های میله ای شکل گرم مثبت هستند که گاهی واجد دانه های قطبی یاگرانول های متاکروماتیک پلی متا فسفات می باشند . باسیل ها مستقیم یا کمی خمیده اند و ممکن است به شکل بیضی با انتهای نوک تیز یا گرزی شکل به صورت منفرد یا جفت شبیه حرف V و Lیا در گروههای چند تایی موازی و شبیه حروف چینی دیده میشوند . این باکتری ها بدون اسپور بوده ، بی هوازی اختیاری ، کاتالاز مثبت ، بدون کپسول، بی حرکت(بجزگونه های C.aquaticumکه نام جدید آنLeifsonia aquatica است؛و C. matruchotii) ؛ و غیر اسید فست هستند . دمای رشد مناسب آنها35 تا 37 درجه سانتی گراد می باشد . تاکنون42گونه مختلف ازکورینه باکتریوم هاراشناسایی نموده اند که اغلب آنها واجدمقادیرکمی اسیدمایکولیک (mycolic acid) در دیواره سلولی خود هستند و برخی فاقداین ماده می باشند . عده ای ازمیکروب شناسان نظیر Barreauو De Brielمعتقدند که باکتری های فاقد اسید مایکولیک را نمی توان در جنس کورینه باکتریوم قرار داد . چنین باکتری هایی را که از نظر شکل و برخی خصوصیات بسیار شبیه کورینه باکتریوم ها هستند ، تحت عنوان باکتری های کورینه فرم(Coryneform ) که معادل اصطلاح �دیفتروئید� (Diphtheroid)است،نامگذاری نموده اند مانند جنس های Arthrobacter , Brevibacterium Microbacterium , Turicella , Cellulomonas , Leifsonia , Kurthia , Exiguobacterium , Dermabacter,و گروه CDC .

اغلب کورینه باکتریوم ها می توانند در محیطهای کشت خوندار مثل بلاد آگاد و شکلات آگار و یا در محیط کشت تیوگلیکولات یا BHI بخوبی رشد کنند ، ولی از رشد در محیط مکانکی آگار عاجزند. شاخص ترین گونه بیماریزای این جنس ،
کورینه باکتریوم دیفتریه(C.diphtheriae) عامل بیماری � دیفتری� یا�خناق� است . در موارد مشکوک به دیفتری ،
معمولاً از روشهای محیط کشت انتخابی نظیر� سیستین تلوریت بلادآگار� و �تینسدال آگار اصلاح شده � استفاده می گردد . این محیطها را پس از تلقیح باکتری حداقل به مدت 48 ساعت در c�35 نگهداری می کنند .همچنین محیط کشت � لوفلر � حاوی سرم و تخم مرغ،رشدکورینه باکتریوم دیفتریه و تشکیل دانه های متاکروماتیک در داخل جسم باکتری را تقویت میکند. تلقیح نمونه برداشتی ازگلو توسط سواب به سطح محیط � لوفلر� و انتقال هر گونه رشد از آن، پس از یک شب انکوباسیون به محیط کشت �سیستین تلوریت بلاد آگار�امکان جداسازی کورینه باکتریوم دیفتریه را افزایش می دهد . این باکتری در محیط کشت� سیستین تلوریت بلاد آگار� کلنی های سیاه یا خاکستری رنگ و در محیط� تینسدال آگار� کلنی های سیاه رنگ با هاله قهوه ای تیره ایجاد می کند. منظره خاص کلنی ها ی کورینه باکتریوم دیفتریه در محیط� تینسدال آگار� و نیز عدم همولیزاوره ،از وجوه افتراق این گونه باکتری از سایرگونه ها محسوب میشود .

باسیل دیفتری ، فرمانتاتیو بوده و دارای چهار زیر گونه یا بیوتیپ است . وجوه تمایز این زیر گونه ها یابیوتیپ ها و همچنین دیگرکورینه باکتریوم ها ی هم گروه یعنی
C.pseudotuberculosis و C.ulcerans که هما نند باسیل دیفتری ،فرمانتاتیو، غیر چربی دوست و تینسدال مثبت هستند، در جدول نشان داده شده است . دو گونه مذکور حاوی فعالیت فسفو لیپاز D هستند و بدین وسیله از بقیه گونه ها متمایز می گردند .

اغلب کورینه باکتریوم هایی که ازنظر بالینی اهمیت دارند،
معمولا کاتالاز مثبت ، بی حرکت ،بدون پیگمان ، اسکولین و ژلاتین منفی اند ،بنابراین در جداسازی ارگانیسمی که فاقد چنین مشخصاتی باشد ، سایر جنس های باکتریایی از کورینه فرم ها را بایستی مد نظر قرار داد . همچنین باسیل گرم مثبت نامنظمی که هوازی اجباری و غیر چربی دوست (non lipophilic) بوده و گلوکز را اکسیده کرده و یا از مصرف این قندعاجزباشد،احتمالاً �لیفسونیاآکواتیکا�،�آرتروباکتر�، �برویباکتریوم� یا�میکروباکتریوم� خواهد بود . تقویت و افزایش رشد در محیط کشت بلاد آگار یا BHI براث حاوی چربی(سرم خرگوش یا یک درصد(Tween 80توسط C.jeikeium urealyticum C. وکورینه فرم های چربی دوست (Lipophilic) برای شناسایی این باکتری ها مفید واقع میشود . دو گونه مذکور که هوازی اجباری و غیر فرمانتاتیو هستند به اغلب نتی بیوتیکهای مورد استفاده برای باکتری های گرم مثبت، مقاوم و تنها به وانکومایسین حساس اند . گونه �اوره آلیتیکوم� برخلاف گونه اول ، اوره آز مثبت است .

اغلب کورینه باکتریوم ها و کورینه فرم ها که قبلاً به عنوان غیر بیماریزا و عوامل آلوده کننده نمونه های بالینی اخذ شده از نقاط مختلف بدن معروف بودند ، امروزه در شرایطی بویژه در بیمارانی که سیستم ایمنی بدنشان تضعیف شده باشد ، نیز حایز اهمیت بالینی هستند .

تشخیص افتراقی گونه های رایج کورینه باکتریوم هایی که توانایی ایجاد بیماری درانسان را دارند، می توانیددردیاگرام های 1و 2 ملاحظه نمائید .

جنس لیستریا (Listeria):

باسیل های گرم مثبت کوتاه (کوکوباسیل ) بدون شاخه با دوانتهای گرد هستند که در کشت های کهنه ، گرم متغیر و کوکسی شکل بنظر می رسند . این باکتری ها به تنهایی یا بصورت زنجیره کوتاه و گاهی به صورت رشته ای و یا پالیساد قابل رویت اند ،مواقعی نیز که در وضعیت دوتایی قرار گیرند ممکن است با پنوموکوک اشتباه شوند . این باکتری ها همانند کورینه باکتریوم ها، کاتالاز مثبت، فاقد کپسول، غیراسیدفست، اکسیدازمنفی اند و فاقد اسید مایکولیک در دیواره سلولی خود می باشند و دمای رشد مناسب آنها 30تا 37 درجه سانتی گراد است . از ویژگیهای مهم اعضای جنس لیستریا، متحرک بودن آنها دردمای اتاق (20 الی 25 درجه سانتی گراد ) می باشد که این باکتری ها را از کورینه باکتریوم ها متمایز می سازد . نحوه حرکت لیستریا در لام مرطوب نیز منحصر به فرد بوده و با یک حرکت چرخشی خاص ( tumbling motility) به صورت معلق زدن باکتری از یک انتها به سمت انتهای دیگر خودمشخص می گردد . برای مشاهده این نوع حرکت ، باکتری را در نوترینت براث تلقیح نموده و به مدت یک تا دو ساعت در دمای اتاق نگهدار ی می نمایند . قطره ای از این سوسپانسیون را بین لام
ولامل قرار داده و با درشت نمایی 40� میکروسکوپ بررسی می نمایند . در محیط نیمه جامد مانند SIM،این حرکت با منظره ای شبیه� چتر� باز شده پس از تلقیح باکتری و یک شب انکوباسیون در دمای اتاق متجلی خواهد شد ، در حالی که باکتری در ˚c37معمولاً غیر متحرک است و چنین منظریه ای پدیدار نخواهدشد .

تاکنون 8 گونه مختلف از جنس لیستریا شناسایی شده است که شاخصترین آنها� لیستریامونوسیتوژنز�(L.monocytogenes) می باشد . این باکتری توانایی رشد در ˚c4 و نیز در حضور 10% کلرور سدیم را دارد . همچنین در آگار خوندار، هاله باریکی از همولیز بتا ایجاد می کند و تست CAMP (در حضور استافیلوکوکوس اورئوس ) مثبت است (گاهی این باکتری ممکن است با استرپتوکوکوس آگالاکتیه که تست کمپ مثبت است ،اشتباه شود . لیستریا مونوسیتوژنز برخلاف استرپتوکوکوس آگالاکتیه ،کاتالاز مثبت و تست هیدرولیز اسکولین مثبت می باشد) .

علاوه بر خصوصیات ذکر شده ، لیستریا مونوسیتوژنز ،گلوکز، رامنوز ،هیدرولیز هیپورات ، متیل رد ،وژه پروسکوئر مثبت ولی H_2S ،احیای نیترات ، مانیتول ، ریبوز ، نشاسته ، زایلوز ، ذوب ژلاتین ،اندول و اوره آز منفی است .

لیستریامونوسیتوژنز تنها گونه بیماریزا در انسان است . لیستریا ایوانووئی (L.ivanovii) سبب سقط جنین درحیوانات میگردد . سایر گونه ها غیر بیماریزا هستند . وقتی جدا سازی لیستریا مونوسیتوژنز از برخی نمونه ها (مانند جفت و سایر بافتها ) مشکل باشد ، می توان با روش تقویت و یا تغلیظ باکتری درسرما (Cold enrichment) امکان ایزو لاسیون آن را افزایش داد . بدین ترتیب که نمونه جمع آوری شده را در نوترینت براث در دمای ˚c4 به مدت چند هفته تا چند ماه
نگهداری می کنند و سپس براث را به دفعات در محیطهای کشت پاساژ می دهند تا باکتری تقویت یافته در چنین شرایطی به صورت خالص بدست آید . وجوه تمایز گونه های مختلف جنس لیستریا را می توانید در دیاگرام 3 ملاحظه نمائید .

جدول : کورینه باکتریومهای فرمانتاتیو غیر چربی دوست و تینسدال مثبت